Métodos variados de separación de mezclas se conocen como cromatografía. Según la definición dada por Keulemans la cromatografía es un método de separación en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario.

La cromatografía se introduce en los métodos de separación en 1903 y su posterior desarrolló y evolución se produce hacia 1930. La primera persona que definió la cromatografía fue el botánico ruso Miguel Tswett (1872-1913) en 1906 y eligió el término cromatografía procedente de las palabras griegas khromatos (color) y graphos (escrito) ya que utilizó el término cromatografía para describir la separación de pigmentos vegetales en distintas zonas coloreadas. Aunque la mayor parte de las separaciones que se realizan actualmente son de compuestos incoloros, el término inicial cromatografía se ha mantenido.
Definición de cromatografía

En 1906 Tswett definió la cromatografía como:

Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente.

Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como:

Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc...

Se utiliza el término general de lecho para definir las distintas formas en que puede encontrarse la fase estacionaria. Las separaciones cromatográficas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser :

1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.

2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial.

Aspectos históricos de la cromatografía

Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a través de arcilla, rocas, etc... la cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como papel.

En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dió el nombre de cromatografía. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.

Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo de la bioquímica, y así Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados.
Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía.
Cromatografía en papel

Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Adquirió una gran extensión por su sencillez y presenta la ventaja de poder utilizar miligramos y microgramos, además presenta la opción de utilizar tanto la técnica descendente ( en columna, etc...) como la técnica ascendente.
Cromatografía en capa fina

Fue originada por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen en 1938 al separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte, la dificultad que presentaba el método era el crear una capa homogénea, sin ningún tipo de rugosidad. La cromatografía en capa fina tuvo valor limitado hasta que Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos.
Cromatografía de intercambio iónico

Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico.
Cromatografía de gel-filtración

Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se consigue separar polímeros sintéticos de alto peso molecular.
Cromatografía de afinidad.

Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o proteína unida covalentemente a un ligando y se utiliza para la separación de moléculas proteicas.
Cromatografía de gas.

Es una de las técnicas más utilizadas e importantes, de forma que ha revolucionado el campo de la química analítica.

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

APUNTES DE CROMATOGRAFIA

La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los mismos.

 Principios
 La palabra Cromatografía significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente  llamado eluente (fase móvil) a través de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las moléculas que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separación entre la fase estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o gaseosa

Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la absorción.

El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de  la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.

Clasificación de la Cromatografía

Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos, según su fase móvil se clasifica en  Cromatografía de gases que puede ser a través de dos sistemas, gas- líquido y gas-sólido y Cromatografía líquida donde el eluente es un líquido y puede ser líquido-liquido, liquido-sólido. Por el mecanismo de retención-separación, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografía de reparto, de adsorción y de exclusión. Según la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana. También se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala física y gradientes.

Técnicas cromatográficas

Cromatografía en capa fina.

Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más  utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.
  La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza  por medio de métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
    El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.

Cromatografía en papel.

 El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.

Cromatografía en Columna.

Cromatografía de gases.

Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.

La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separación. La columna  de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón  contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y  ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias,  midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes.  La salida  de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico.

Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).

Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta  o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar  la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

Cromatografía de intercambio iónico.

La Fase Estacionaria  es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

Cromatografía por Permeabilidad en Gel.

Es útil para la separación de proteínas.

 La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.

Cromatografía de Afinidad.

La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

Cromatografía de afinidad

Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.

Fundamento de la cromatografía de afinidad

En la figura  se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.

La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas

  Alta selectividad en el mecanismo de retención

  Campo de aplicación restringido

  Separación de un solo soluto analito

  Empleo de sistema de baja presión

  Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica

Ligandos de afinidad

Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.

Esquema de un cromatograma de afinidad.

Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.

Inmovilización de ligandos

La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas.

El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:

Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que secaracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.

Metodos de elusión

Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.

La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la lectina.

La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.

En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan.

(High Performance Liquid Chromatography)

Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida "clásica" se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

* Tipos de Cromatografía Líquida
o

Cromatografía de Partición.
*

Cromatografía de Adsorción
*

Cromatografía Iónica
* Cromatografía de Exclusión

Diagrama Básico de un sistema de HPLC

* Eleccción del Solvente

Características:
o

Disponible comercialmente
*

Precio
*

Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impuresas.
*

Disolver la muestra
*

Misible con otros solventes para formar mezclas útiles
*

No degradar o disolver la fase estacionaria
*

Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
* Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)Filtración y Desgasificación de solventes
o
+
#

Filtro a la Entrada del Solvente

Métodos de Filtración de Solventes en HPLC

Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC :

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Técnicas del Laborario Moderno más importantes como herramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos. Como en todas las técnicas analíticas, los pequeños problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolución de los cromatografos líquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que ésta no puede resolver.

Hasta los Solventes para HPLC, tods filtrados cuidadosamente en la fábrica, pueden acumular partículas en suspención que pueden ser perjudical a los componentes del sistema HPLC. Estas partículas en suspención pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposición al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depósito para solvente, la exposición a partículates del aire durante el almacenamiento del solvente en el depósito del solvente, la degradación lenta del recipiente solvente, o de condensación y polimerización del solvente. Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmósfera. El trasegado del solvente en el depósito solvente y su almacenamiento en estos depósitos máseste fenómeno. El Oxígeno Disuelto que constituye el 21% de la atmósfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.
*

Filtración al Vacío
* Filtración en Línea
Sonificación

Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

Existen cuatro(4) métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:
*

Burbujear Helio
*

Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
* Desgasificación al Vacío en LíneaBombas

Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo:
o

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
*

Mantener el flujo libre de pulsaciones
*

Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
*

Control y reproducibilidad del flujo de solvente
* Componentes de la bomba resistentes a la corrosiónLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:
o

Mecánicas
+

Recíprocantes
*

De desplazamiento contínuo
o Neumáticas

Programación del Solvente

Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:
o Isocrático

*
o

Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
+

A baja presión
* A alta presión
o
+

Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible.

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos objetivos:
* Asegurar alta presición y exactitud.
o
+

Determinar la composición inicial y final del solvente

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasos fundamentales:
*

Ajustar el tiempo del gradiente
*

Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
*

Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusión
* Regresar a las condiciones iniciales la columna.Sistemas de Inyección de muestra

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vávulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias

Tipos de Columna:
Fuentes de daño de una columna de HPLC:
* Obstrucción por partículas pequeñas en los solventes o fases móviles
* Obstrucción por materiales no eluídos en las muestras
* Variación de las características de retención por incremento de materiales no eluídos

Detección

La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del efluente, así como también de lascaracterísticas de las señal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
o

Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refracción
* Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector UltravioletaLos detectores más utillizados en HPLC son:
o

Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
+

Detector de Longitud de Onda Fija
*

Detector de Longitud de Onda Variable
*

Detector de Arreglo de Diodos
o

Detector de Indice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:
+

Tipo Deflexión
*

Tipo Fresnel
o

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización .
*

Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
o
+

Según la Fuente de Excitanción
*

Según el sistema óptico
o

Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
+

Detector Amperométrico
*

Detector Conductimétrico
*

Detector Potenciométrico

Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroquímicos para asegurarse análisis reproducicbles:
o
+
#

Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador (integrador.
*

Usar bombas reciprocantes de doble piston
*

Mantener en todo momento el flujo de la fase móvil en el detector.
*

Operar con el voltaje adecuado
*

Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos.
*

Tener electrodos de referencias extras en solución 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 ó 2 veces a la semana.
*

Desconectar el detector electroquímico cuando este llimpiando las columnas.
* Utilizar agua, buffers y solventes orgánicos de alta pureza.Derivatización

Existen dos tendencias :
o

Pre-Columna
* PostColumnaAnalisis Cualitativo y Cuantitativo

Problemas más comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas posibles, y cómo solucionarlos.
o

Presión Alta
+

Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas.
*

Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si ésto no funciona reemplaze el fritado a la entrada de la columna. Si la presión sigue alta reemplaze la columna.
*

Solución a largo plazo: Asegurese que todas las fases móviles se filtren apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
o

Pérdida de la Resolución
+

Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas.
*

Solución: vea la sección de Presión Alta
*

Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.
o

Picos Hendidos
+

Posible causa : Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas.
*

Solución: Marcha atrás columna roja con presión baja está al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna.
*

Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.
o

Variación en los Tiempos de Retención
+

Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil.
*

Solución: Bomba primera y está fases seguras tan móviles es propiamente [degassed]
*

Solución a larga plazo: Asegurese fase tan móvil está propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en línea asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing] completo.
o

Variaciones de la Línea Base
+

Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los solventes de la fase móvil.
*

Solución: Asegurese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector.
o

Línea Base con mucho Ruido
+

Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
*

Solución: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase movil del sistema.
o

Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)
+

Posible causa: Oxígeno Disuelto
*

Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto.
*

Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto.
o

Baja ó Ninguna Presión
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Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas en suspención en la fase móvil.
* Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC

Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus necesidades:
o

Cuántas muestras y tipos de ensayos
*

La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento)
*

La exactitudad y presición del sistema de bombas
*

El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
*

Que tipo de servicio ofrecen ó puede ofrece la casa vendedora
*

Suministro de software y compatibilidades
* Cuánto puede PAGAR usted !

HPLC

GC

con información sobre las condiciones en las cuales fueron realizados los cromatogramas

http://www.chem.agilent.com/scripts/chromatograms.asp

http://www.discoverysciences.com/chromdb/default.aspx

¿Alguien me sabe decir lo que es esto?

Bueno, como ya habréis podido deducir por el título de esta entrada, se trata de una cromatografía en papel. Bueno, ¿pero cromatografía de qué?.

Pues, empezando por el principio, como debe ser, ésta era una práctica de la asignatura Fisiología Vegetal, muy chula, por cierto.

Dicha práctica consistía en extraer los pigmentos fotosintéticos de hojas de espinaca. Como sabréis éstos son Clorofilas y Carotenoides. Ambos pigmentos forman parte de un complejo que se encuentra en los cloroplastos de las células vegetales y otros organismos fotosintéticos, son los llamados pigmentos antena, que se acoplan a los centros de reacción de los fotosistemas y los centros de reacción.

Los Pigmentos Antena se encargan de captar la energía de la luz solar y canalizarla hasta el centro de reacción del fotosistema.

Esta canalización consiste en la excitación de un electrón de un pigmento que al volver a su "posición inicial" desprende una energía que servirá para excitar el electrón de un pigmento adyacente y así sucesivamente hasta llegar al centro de reacción.

En el centro de reacción se excitará un electrón procedente de la Clorofila, que será captado por una serie de proteínas intermediarias hasta reducir una molécula de NADPH + (H+). Ésta cederá sus electrones y protones a la cadena transportadora de la membrana tilacoidal del cloroplasto y terminará formando ATP. De esta forma tan bonita las plantas transforman la energía solar en energía metabólica para formar moléculas orgánicas en el metabolismo.

Bueno, fuera de esta introducción teórica plagada de tecnicismos, paso a presentaros a las Clorofilas...

- Clorofila a

- Clorofila b

De color Verde.

...Y a los Carotenoides...

- Carotenos

- Xantofilas (se diferencian de los carotenos por tener grupos polares o solubles en sus extremos).

Colores rojos, naranjas y amarillos.

Los Carotenoides se suelen localizar en los Pigmentos Antena y las Clorofilas en los Centros de Reacción (si no recuerdo mal).

Pero bueno, dicho todo esto vayamos al grano.

La práctica ha consistido en triturar hojas de espinaca en un mortero e ir disolviendo la pasta con distintos disolventes: Éter y Acetona, repitiendo esta disolución varias veces íbamos obteniendo los pigmentos de distinta propiedad química: polares o apolares.

En un embudo de decantación...

... ibamos añadiendo los sobrenadantes (el líquido con los pigmentos disueltos que quedaba sobre la pasta de espinaca triturada) y según el disolvente: polar o apolar, se formaron dos capas. Fuimos recogiendo todo lo que quedaba bajo la capa apolar, pues flotaba sobre la polar, hasta quedarnos solamente con la apolar y verterla en un tubo de ensayo.

Acto seguido, pusimos varias gotas de esta capa apolar con pigmentos apolares disueltos en una tira de papel de filtro. Después lo introducimos en un bote con una disolución de propanol en éter de petróleo en el fondo, un disolvente apolar que se uniría a moléculas apolares. Por capilaridad, dicha disolución iba ascendiendo por el papel de filtro, arrastrando los pigmentos que habíamos depositado en éste gota a gota. y el resultado ha sido el de la imágen principal de la entrada, osea, esta:

Ante todo tengo que decir que no nos ha salido del todo bien a mi compañero y a mí, pero este ha sido nuestro resultado.

La explicación de por qué se han formado estas bandas la cuento después de hablar de lo que es un compuesto polar y un compuesto apolar, por si alguien no lo sabe.

Compuesto apolar: es una sustancia formada por moléculas que no se pueden disolver en agua por no presentar ningún radical químico que establezca puentes de hidrógeno con las moléculas de agua del medio, con lo cual la repelen. Pero sí son solubles en compuestos de su misma naturaleza química, es decir: hidrofóbicos.

Un ejemplo: el aceite de oliva.

Compuesto polar: es una sustancia formada por moléculas que se pueden mezclar con las moléculas de agua dado que pueden establecer enlaces de puente de hidrógeno con ellas, al contener grupos radicales con átomos electronegativos como oxígeno, nitrógeno, azufre, flúor (caso muy raro), etc. Estas moléculas no se disolverán bien en disolventes apolares, como el propanol en éter de petróleo.

Dicho esto, atendiendo a la naturaleza polar y apolar de los pigmentos que tratamos: Cloforilas y Carotenoides, tendremos distintas bandas. Las primeras en formarse corresponden a los compuestos más grandes y polares, que no han podido ser arrastrados bien por el propanol en éter de petróleo, es decir: los carotenoides polares: Xantofilas, las siguientes serán las Clorofilas más polares: Clorofila b, las siguientes las Clorofilas apolares: Clorofila a; y por último los carotenoides más apolarares: Carotenos.

De esta forma tenemos esas bandas amarillentas por debajo, unas bandas verdes encima de éstas, otra banda verde más intenso y una banda amarilla arriba del todo.

Y esta ha sido nuestra práctica de hoy, la cual nos ha encantado a casi todos.

Espero que os guste.

Saludos ;)

Esta técnica fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de petróleo, un disolvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a través de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza). Tswett tilizó como detector del experimento la simple observación, ya que los compuestos que separó tenían color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas.

A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este método diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente para
separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier técnica que se base en los mismos principios.
La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior, rellena de un sólido común donde el eluyente se mueve conducido por su propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos.
En la cromatografía se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o líquida, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.

Como resultado hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la separación de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos según el mecanismo de separación:

• C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad.
• C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción.
• C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular.
• C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica.

También se pueden clasificar según el estado de la fase móvil en :

• C. de gases: la fase móvil es un gas y pueden ser dos sistemas:
o C. gas-liquido
o C. gas-sólido

• C. líquida: la fase móvil es un liquido y puede ser:
o C. liquido-liquido
o C. liquido-sólido
o C. de exclusión
o C. de intercambio ionico

Las únicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografía son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria.
Dentro de las técnicas cromatográficas no se incluyen los métodos que utilizan campos eléctricos para separar moléculas cargadas, métodos que se denominan
electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis.
El proceso cromatográfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unión de fenómenos tales como hidrodinámica, cinética, termodinámica, química de
superficie y difusión. Hasta la fecha se han propuesto muchas teorías, que incluyen complejos matemáticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las
columnas cromatográficas.